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Eller, … Joseph A. BaurH. Wang, X. Yan, … M. Hayer-HartlNature Plants Band 9, Seiten 157–168 (2023) Zitieren Sie diesen ArtikelEine Autorenkorrektur zu diesem Artikel wurde am 20. Februar 2023 veröffentlichtDieser Artikel wurde aktualisiertDie letzten Schritte der Zellatmung – ein essentieller Stoffwechselprozess in Pflanzen – werden durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung durchgeführt.Dieser Prozess umfasst eine Kette von Membranproteinkomplexen mit mehreren Untereinheiten (Komplexe I–V), die Anordnungen höherer Ordnung bilden, die als Superkomplexe bezeichnet werden.Obwohl Superkomplexe die physiologisch relevanteste Form der oxidativen Phosphorylierungskomplexe sind, bleiben ihre Funktionen und Strukturen weitgehend unbekannt.Hier präsentieren wir die kryogene elektronenmikroskopische Struktur des Superkomplexes I + III2 aus Vigna radiata (Mungobohne).Die Struktur enthält das vollständige Untereinheiten-Komplement von Komplex I, einschließlich einer neu zugeordneten, pflanzenspezifischen Untereinheit.Es zeigt auch Unterschiede in der mitochondrialen Processing-Peptidase-Domäne von Komplex III2 relativ zu einem zuvor bestimmten Superkomplex mit Komplex IV.Die Superkomplex-Schnittstelle erinnert zwar an die in anderen Organismen, ist aber pflanzenspezifisch, wobei eine Hauptschnittstelle die mitochondriale prozessierende Peptidasedomäne von Komplex III2 und keine Beteiligung der Brückendomäne von Komplex I umfasst.Die Komplex-I-Struktur deutet darauf hin, dass die Brückendomäne den Winkel zwischen den beiden Armen des Enzyms festlegt und großflächige Konformationsänderungen begrenzt.Darüber hinaus deuten die katalytischen Schleifen von Komplex I und seine Reaktion in Aktiv-zu-Deaktiv-Assays darauf hin, dass der ruhende Komplex in V. radiata einen nicht-kanonischen Zustand annimmt und selbst in Gegenwart von Substrat deaktive oder offene Konformationen abtasten kann.Diese Studie erweitert unser Verständnis der möglichen Konformationen und des Verhaltens von Komplex I und Superkomplex I + III2.Weitere Untersuchungen des Komplexes I und seiner Superkomplexe in verschiedenen Organismen sind erforderlich, um die universellen und kladenspezifischen Atmungsmechanismen zu bestimmen.Die Zellatmung ist ein essentieller Stoffwechselprozess in Pflanzen.Die letzten Schritte der Atmung werden durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) durchgeführt.In seiner kanonischen Form umfasst OXPHOS vier aus mehreren Untereinheiten bestehende Proteinkomplexe der Elektronentransportkette (Komplexe I–IV, CI–CIV) sowie die mitochondriale ATP-Synthase (Komplex V).Die Komplexe I–IV übertragen Elektronen von NADH oder Succinat auf molekularen Sauerstoff durch die Elektronentransporter Chinon und Cytochrom c und bauen einen elektrochemischen Protonengradienten über dem IMM auf.Dieser Protonengradient wird dann vom Komplex V abgebaut, wodurch ATP1 entsteht.OXPHOS-Komplexe können unabhängig voneinander existieren, lagern sich jedoch häufiger zu stöchiometrischen Anordnungen höherer Ordnung zusammen, die als Superkomplexe bezeichnet werden und deren Funktionen unklar geblieben sind2,3,4,5,6,7.In Pflanzen wurden zwischen 50 % und 90 % des CI nach der Detergensextraktion aus dem IMM und der nativen Gelelektrophorese mit CIII2 (SC I + III2) assoziiert gefunden, was wahrscheinlich das Ausmaß der Superkomplex-Assoziationen in vivo unterschätzt8.Um die physiologischen Funktionen von CI – dem Haupteintrittspunkt von Elektronen in OXPHOS – vollständig zu verstehen, müssen wir es daher im Kontext seiner Superkomplexe untersuchen.Die biochemische und strukturelle Analyse von SC I + III2 ist ein entscheidender Schritt zum Verständnis respiratorischer Superkomplexe in Pflanzen.Kürzlich wurden mehrere kryogene Elektronenmikroskopie(kryoEM)-Strukturen für Pflanzen-CI oder CI-Fragmente erhalten9,10,11.Zusätzlich sind Strukturen für SC I + III2 von Ovis aries (Schaf) und Tetrahymena thermophila verfügbar12,13.Während diese Strukturen unser Verständnis der Anlage SC I + III2 unterstützen, sind sie nicht ausreichend.Beispielsweise sind alle Strukturen von Pflanzen-CI unvollständig, es fehlt die Untereinheit NDUA11 sowie die Dichte für Transmembranhelices (TMHs) in den Kernuntereinheiten Nad5 und Nad6.Außerdem blieben mehrere Dichten unzugeordnet, darunter die für eine mutmaßliche neue Untereinheit, deren Identität nicht bestimmt werden konnte9,10,11.Darüber hinaus fehlen in den Pflanzenhomologen Sequenzen, die an der SC I + III2-Bildung in O. aries und T. thermophila beteiligt sind (z. B. aus NDUB4 und NDUB9), und es gibt wesentliche Unterschiede in den SC I + III2-Schnittstellen zwischen Schafen und T .thermophila SC I + III2.Daher können diese Strukturen nicht direkt verwendet werden, um Vorhersagen über die Anlagen-SC-Schnittstelle(n) zu machen.Darüber hinaus sind zwar Rekonstruktionen der Pflanze SC I + III2 aus subtomographischen Mittelwerten von Asparagus officinalis7 und Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung von Arabidopsis thaliana14 verfügbar, ihre Auflösungen sind jedoch zu gering, um detaillierte Bewertungen vorzunehmen.In diesem Artikel stellen wir eine hochaufgelöste Struktur von SC I + III2 aus Vigna radiata (Mungobohne) aus einem biochemisch aktiven Präparat vor.Diese Struktur enthält das vollständige Komplement der Untereinheiten für Pflanzen-CI, einschließlich NDUA11 (B14.7), zuvor fehlender Fragmente von Nad5 und Nad6 und einer neu zugewiesenen CI-Untereinheit (NDUP9).Darüber hinaus enthält CIII2 eine andere Isoform der mitochondrialen Processing-Peptidase (MPP)-&agr;-Untereinheit als die, die in isoliertem CIII2 und SC III2 + IV beobachtet wird (Ref. 15).CI und CIII2 interagieren an drei Stellen, an denen die Brückendomäne von CI nicht beteiligt ist.Im Gegensatz zu einer früheren Hypothese aus dem CI von A. thaliana (Ref. 11) legt unsere Analyse nahe, dass die Öffnung des Komplexes wahrscheinlicher auf einen Probenabbau als auf einen regulatorischen Prozess zurückzuführen ist.Darüber hinaus legt eine Untersuchung der großräumigen Struktur von CI, der katalytischen Schleifen und der Aktiv-zu-Deaktiv-Reaktion (A/D) nahe, dass die Ruhekonformation von V. radiata CI ein intermediärer, nicht-kanonischer Zustand ist und dass CI ähnliche Zustände in beiden abtastet Fehlen und Vorhandensein von Substrat.Wir isolierten Mitochondrien aus etiolierten Mungobohnen-Hypokotylen.Wir haben dann Proteinkomplexe aus den mitochondrialen Membranen mit dem sanften Detergens Digitonin extrahiert und sie mit amphipathischen Polymeren stabilisiert (Erweiterte Daten Abb. 1a, b).Unter Verwendung eines Saccharosegradienten haben wir Atmungskomplexe und Superkomplexe teilweise gereinigt (Erweiterte Daten, Abb. 1c, d).Wir haben die Fraktionen, die SC I + III2 (Erweiterte Daten, Abb. 1c, d) enthalten, gepoolt, Puffer ausgetauscht und konzentriert und diese teilweise gereinigte Probe verwendet, um CryoEM-Raster zu blotten, wie zuvor beschrieben9,13,15.Wir haben SC I + III2 unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter gereinigt (Erweiterte Daten, Abb. 1e, f).Die endgültige biochemische Probe zeigte die erwartete NADH-cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivität, die durch die CI- und CIII2-Inhibitoren Piericidin A bzw. Antimycin A gehemmt wurde (Abb. 1a).a, NADH-Cyt-c-Oxidoreduktase-Aktivität von Amphipol-stabilisiertem, isoliertem SC I + III2 in Abwesenheit oder Gegenwart von CI- oder CIII2-Inhibitoren (20 μM Piericidin A bzw. 1 μM Antimycin A).Die Werte sind Mittelwerte aus drei oder vier unabhängigen Messungen einer einzelnen gereinigten Probe von SC I + III2;Fehlerbalken zeigen den Varianzkoeffizienten an, der als Summe der Variationskoeffizienten jedes experimentell bestimmten Werts (Weglänge, Extinktionskoeffizient und Aktivität) multipliziert mit dem Mittelwert berechnet wird.b, CryoEM-Dichtekarte von SC I + III2, gefärbt nach Untereinheit.Die ungefähren Positionen der mitochondrialen Matrix und des Intermembranraums (IMS) sind mit schwarzen Linien dargestellt.c, Verbesserung des atomaren Modells gegenüber zuvor verfügbaren Strukturen von Pflanzen-CI.Verbesserte oder neue Untereinheiten, die in farbigen Cartoons über einer halbtransparenten CI-Oberfläche angezeigt werden.Cter, C-Terminus.d,e, SC I + III2, dargestellt aus der Matrix (d) oder der Ebene der Membran (e).Komplex I (CI) in blauer Fläche, Komplex III2 (CIII2) in grüner Fläche.Unsere KryoEM-Bildverarbeitung führte zu zwei anfänglichen Rekonstruktionen von SC I + III2, die die vollständige Ergänzung der Untereinheiten enthielten („verbrückte“ SC I + III2) mit einer Auflösung von 3,3 Å und 3,6 Å (Klasse 1 bzw. Klasse 2) (Erweiterte Daten Abb. 2 und erweiterte Datentabellen 1 und 2).Die dreidimensionale Variabilitätsanalyse (3DVA) aller verbrückten SC I + III2-Partikel zeigte, dass die meiste Variabilität in den verbrückten Partikeln von der flexiblen Schnittstelle zwischen CI und CIII2 herrührte (Ergänzungsfilme 1 und 2), was zu einer Karte von insgesamt geringerer Qualität für führte CIII2 in beiden Klassen (Erweiterte Daten Abb. 2).Um die inhärente Flexibilität der Partikel zu überwinden, führten wir gezielte Verfeinerungen an den verbrückten SC I + III2-Klasse-1-Partikeln durch, indem wir Masken um die Brückendomäne von CI, die „Ferse“ von CI, das N-Modul von CI, das Modul der distalen Pumpe (Pd) von CI und CIII2 ( Erweiterte Daten Abb. 3 und erweiterte Datentabelle 1).Eine weitere Verbesserung der CIII2-Kartenqualität wurde durch eine anschließende fokussierte Verfeinerung um die MPP-Domänen herum erreicht (erweiterte Daten Abb. 3 und erweiterte Datentabelle 1).Diese fokussierten verfeinerten Karten wurden zu einer zusammengesetzten Karte mit einer Nennauflösung von 3,2–3,6 Å kombiniert (Abb. 1b, Erweiterte Daten Abb. 3 und Erweiterte Datentabelle 1).Zusätzlich zu den verbrückten Klassen wurden weniger besetzte Klassen für SC I + III2 identifiziert, denen die Ferredoxin-Brücke und andere Untereinheiten fehlten („brückenlose“ SC I + III2) und für CI allein (erweiterte Daten Abb. 2 und erweiterte Datentabelle 2). ).Die brückenlosen Partikel könnten in vier Klassen eingeteilt werden, die weiter unten diskutiert werden.Der Rekonstruktion von isoliertem CI fehlte eine klare Dichte für die Brücke, NDUA11 und TMHs in Nad4-Nad6, und sie zeigte eine schlechte Dichte für das Pd-Modul, was mit zuvor veröffentlichten Strukturen von Pflanzen-CI übereinstimmt (Lit. 10, 11).Dies deutet darauf hin, dass CIII2 in Pflanzen möglicherweise benötigt wird, um intaktes CI nach der Extraktion aus der Membran zu stabilisieren.Wie die Anordnung und Integrität jedes Komplexes die des anderen beeinflussen kann, wurde bei Säugetieren16 untersucht, muss aber bei Pflanzen noch vollständig untersucht werden.Wir haben das Atommodell für V. radiata SC I + III2 (Abb. 1b–e) auf der Grundlage von zuvor veröffentlichten Strukturen der Pflanzen CI und CIII2 (Lit. 9, 11, 15) erstellt.Die verbesserte Dichte der Karte im Vergleich zu früheren Rekonstruktionen für V. radiata CI-Fragment und CIII2 ermöglichte es uns, mehrere zusätzliche C-to-U-RNA-Bearbeitungsstellen in Nad1, Nad2, Nad3, Nad4, Nad4L, Nad5, Nad6, NDUS2 und NDUS3 zu bestimmen (Lit. 9, 15, 17) (Erweiterte Datentabelle 3).Die SC I + III2-Karte enthielt auch Dichte für Untereinheiten oder Regionen von Untereinheiten an der Schnittstelle zwischen CI und CIII2, die zuvor in anderen CI-Strukturen fehlten.Dies waren die akzessorische Untereinheit NDUA11 (B14.7), der C-Terminus der Kernuntereinheit Nad5, die vierte Transmembranhelix (TMH4) der Kernuntereinheit Nad6 und die Schleife zwischen TMH3 und TMH4 von Nad6 (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 4 ).Dies bestätigte, dass NDUA11 eine echte CI-Untereinheit in Pflanzen ist, und stellte fest, dass der C-Terminus von Nad5 zwei TMHs enthält, wie in Hefe18.Die Positionen der TMH4- und TMH3-4-Schleife von Nad6 haben funktionelle Implikationen, die unten diskutiert werden.Zusätzlich enthielt die Karte eine ausgedehnte L-förmige Dichte für eine Untereinheit in der Nähe von NDUA11, die in früheren Pflanzen-CI-Rekonstruktionen nicht identifiziert wurde9,10,11.Diese L-förmige Dichte erstreckt sich bis in die Grenzfläche zwischen CI und CIII2 und sorgt für Kontakte zwischen den Komplexen, die bei anderen Arten nicht zu sehen sind (Abb. 1c).Unter Verwendung der Dichte, um eine vorläufige Aminosäuresequenz zu erhalten, gefolgt von einer BLAST-Suche, waren wir in der Lage, die Untereinheit als das Produkt des V. radiata-Gens LOC106767179 (Homologe von A. thaliana At1g67785) zuzuordnen.Dies entspricht einem CI-Untereinheitskandidaten, wie durch Massenspektrometriestudien bestimmt19,20,21, der ursprünglich fälschlicherweise als NDUB5 (Ref. 22) zugewiesen und später in P4 (Ref. 23) umbenannt wurde.Da jedoch die Algen Chlamydomonas reinhardtii und Polytomella sp.enthalten etablierte Komplex-I-Untereinheiten P4–P8 (Lit. 11, 24), um Verwirrung zu vermeiden, schlagen wir vor, diese Untereinheit NDUP9 zu nennen.Diese Untereinheit scheint pflanzenspezifisch zu sein, da Standard-BLAST-Suchen nur Pflanzenarten zurückgaben.Insgesamt liefert diese SC I + III2-Karte das vollständige Komplement der Pflanzen-CI-Untereinheiten (14 Kern- und 34 Zubehörteile; erweiterte Datentabelle 3).Die Karte von SC I + III2 zeigte auch Unterschiede in der MPP-Domäne von CIII2 im Vergleich zu den zuvor verfügbaren Strukturen aus V. radiatas Superkomplex III2 + IV (SC III2 + IV) und CIII2 allein15.Pflanzen enthalten mehrere Isoformen von MPP-α (erweiterte Daten, Fig. 5a).Wir haben zuvor festgestellt, dass in SC III2 + IV beide MPP-α-Untereinheiten dem Gen LOC106774328 entsprechen (Lit. 15).Im Gegensatz dazu war in SC I + III2 die MPP-α-Untereinheit im CIII2-Protomer, das CI am nächsten liegt, eine andere Isoform (entsprechend dem Gen LOC106765382), wie durch die bessere Anpassung dieses Proteins an die Dichte von SC I + III2 ( Erweiterte Daten Abb. 5b).Für MPP-α im anderen Protomer von SC I + III2 ist die Dichte zweideutig, wobei einige Positionen besser zur LOC106765382-Sequenz passen und einige Positionen besser zur LOC106774328-Sequenz passen.Dies deutet darauf hin, dass die Dichte den Durchschnitt einer gemischten Population darstellen könnte oder dass Datenbanken falsch kommentiert sein könnten.Die Hauptunterschiede zwischen Isoformen liegen im N-Terminus, einschließlich einer kurzen Region, die mit CI interagiert (siehe unten).Die funktionelle Relevanz dieser Unterschiede in MPP-α muss noch untersucht werden.Wir beobachteten auch Unterschiede in MPP-β.Während die MPP-β-Isoformen die gleichen waren wie die in SC III2 + IV, war die Helix, die das katalytische Glutamat (Glu217) enthielt, in beiden Protomeren in SC I + III2 teilweise ungeordnet (erweiterte Daten, Fig. 5d, e).Dies führt zu einer Unfähigkeit, das katalytische Zn2+ zu koordinieren (erweiterte Daten, Abb. 5d,e), was die MPP-Domäne funktionsunfähig machen würde.Ob dieser Verlust eine biologisch relevante Folge der Bildung von SC I + III2 ist, muss noch bestimmt werden.Alternativ könnte der Verlust von Zn2+ eine Folge unseres Reinigungsverfahrens sein, das sich geringfügig von dem unterscheidet, das zum Erhalt der SC III2 + IV-Probe verwendet wurde, in der Zn2+ in den aktiven MPP-Stellen zu sehen war15.Es wird interessant sein, diese Befunde an V. radiata SC I + III2 mit denen anderer Pflanzenarten zu vergleichen.Die Mungbohnen-SC I + III2-Karte zeigte drei Schnittstellen zwischen CI und CIII2: (1) eine zwischen NDUB9 (CI), MPP-β (CIII2) und MPP-α (CIII2) gebildete Matrixstelle, (2) eine gebildete IMS-Stelle zwischen NDUP9 (CI), NDUA11 (CI) und QCR6 (CIII2) und (3) eine Membranstelle zwischen NDUA11 (CI) und QCR8 (CIII2) (Abb. 2a–e).Im Gegensatz zu SC I + III2 von T. thermophila, wo die CI-Brückendomäne eine ausgedehnte SC-Schnittstelle bereitstellt13, war die CI-Brückendomäne von V. radiata nicht direkt an der Bildung dieses Superkomplexes beteiligt (erweiterte Daten, Abb. 6a,b).Die MPP-Domäne von CIII2 stellte die größte Schnittstelle bereit, hauptsächlich durch hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen zwischen MPP-β und NDUB9 (Abb. 2c).MPP-α interagiert auch mit NDUB9 über drei Aminosäuren in der N-terminalen Verlängerung von MPP-α, von denen sich zwei zwischen den MPP-α-Isoformen unterscheiden.Beim Vergleich der N-terminalen Verlängerung von MPP-α aus der SC I + III2-Struktur (LOC106765382) mit der in SC III2 + IV (LOC106774328) beobachteten wir, dass die Schleifen ungefähr dieselbe Position einnehmen (erweiterte Daten, Abb. 5c).Darüber hinaus ist der Aspartatrest, der so positioniert ist, dass er eine Salzbrücke mit B9-Arg64 bildet, in beiden MPP-α-Isoformen konserviert.Angesichts der strukturellen Ähnlichkeit, der Konservierung des Aspartats und des minimalen Beitrags von MPP-α zu dieser Grenzfläche ist es unwahrscheinlich, dass diese MPP-α-Schleife ausreichen würde, um die Bildung von SC I + III2 gegenüber SC III2 + IV unterschiedlich zu regulieren.Dennoch bleibt die Hypothese, dass CIII2 mit verschiedenen MPP-α-Isoformen selektiv in verschiedene CIII2-Superkomplexe eingebaut wird, experimentell zu prüfen.Im IMS kontaktierten NDUP9 und NDUA11 QCR6 (Abb. 2d).Während NDUP9 und QCR6 hauptsächlich hydrophobe Wechselwirkungen zeigten, waren die zwischen QCR6 und NDUA11 eher elektrostatischer Natur.Schließlich war die Membranstelle eine kleine Schnittstelle von ein paar Resten auf NDUA11 und QCR8 (Fig. 2e).Wie bei den SC I + III2-Wechselwirkungen von O. aries und T. thermophila waren diese drei Stellen in V. radiata über die Beteiligung von QCR8 am verankernden β-Faltblatt von MPP-β von der IMS mit der Matrix verbunden.a,b, V. radiata SC I + III2-Matrix (a), Grenzflächen zwischen Membran und Intermembranraum (IMS) (b).Interagierende Untereinheiten, dargestellt als farbige Cartoons über der halbtransparenten Oberfläche des Komplexes I (CI) (blau) oder der Oberfläche des Komplexes III2 (grün).Einschub in b zeigt die Schnittstelle, die vom IMS aus betrachtet wird.c–e, V. radiata-Interaktionsdetails für Matrix- (c), IMS- (d) und Membran- (e) Grenzflächen.Untereinheiten als farbige Cartoons mit Schlüsselresten als nach Atomen gefärbte Stäbchen dargestellt.Einige Strukturelemente sind der Übersichtlichkeit halber ausgeblendet.Obwohl die Mungbohnen-SC I + III2-Schnittstellen an die in O. aries und T. thermophila beobachteten erinnerten (z. B. mit NDUB9, NDUA11 und QCR8 in allen drei Organismen), waren die spezifischen Protein- und Aminosäureinteraktionen unterschiedlich (Extended Data Abb. 6c–h).SC-Wechselwirkungen durch NDUP9 scheinen pflanzenspezifisch zu sein.Darüber hinaus zeigten Überlagerungen von V. radiata, T. thermophila und O. aries SC I + III2, dass der Annäherungswinkel zwischen CI und CIII2 zwischen den Organismen unterschiedlich war, wie in den Subtomogramm-Mittelwerten zu sehen ist7.Ein Vergleich der CI:CIII2-Wechselwirkungen und -Orientierung mit anderen Pflanzenarten wird bestimmen, ob die hier beobachteten Schnittstellen über Pflanzenfamilien hinweg gemeinsam sind.Bei mehreren Organismen wurde beobachtet, dass CI mehrere Konformationen annimmt, basierend auf dem Scharnier zwischen seiner Membran und den peripheren Armen18,25,26,27,28.Analoge Konformationen wurden für CI im Säuger SC I + III2 beobachtet, wo es einen unterschiedlichen „geschlossenen“ Zustand und ein Ensemble von „offenen“ Zuständen annehmen kann12.Diese großräumigen Änderungen werden von Konformationsänderungen in Schleifen in der Nähe der Chinon-Bindungsstelle (Nad1 TMH5-6, NDUFS2 β1-2-Schleife und NDUFS7 α1-2-Schleife und α2-β1) und an der Schnittstelle zwischen CIs begleitet Arme (Nad3 TMH2-3 und Nad6 TMH3-4) (Lit. 18, 25, 26, 27, 28).Darüber hinaus kann CI in einigen Organismen einen A/D-Übergang durchlaufen29,30,31.Dies ist ein Off-Pathway-Übergang, der CI in Abwesenheit eines Substrats in einen katalytisch inkompetenten Zustand versetzt und so vor ischämischer Reperfusionsschädigung bei Säugetieren schützt30,31,32,33,34.Da der A/D-Übergang auch durch Konformationsänderungen erfolgt, blieb es umstritten, ob die offenen und geschlossenen Konformationen von CI Zwischenzuständen im Katalysezyklus von CI oder seinen aktiven und deaktivierten Zuständen entsprechen28,35,36,37.In Pflanzen wurde das Vorhandensein des A/D-Übergangs noch nicht untersucht.Daher untersuchten wir die Groß- und Schleifenkonformationen von V. radiatas CI in der SC I + III2-Struktur sowie die Fähigkeit von CI, den A/D-Übergang in mitochondrialen Membranen zu durchlaufen.Unsere KryoEM-Bildverarbeitung identifizierte sechs verschiedene dreidimensionale Klassen: zwei Hauptklassen der oben beschriebenen überbrückten SC I + III2 (~ 72 % der superkomplexen Partikel) und vier kleinere brückenlose Klassen (~ 28 % der superkomplexen Partikel), die sich in der Konformation unterscheiden und Zusammensetzung (Abb. 3 und Erweiterte Daten Abb. 2).Die überbrückten Klassen zeigten nur einen kleinen Unterschied in ihren gesamten CI-Konformationen (Abb. 3a, b und Extended Data Movies 1 und 2).Im Gegensatz dazu zeigten die brückenlosen Klassen eine progressive Zunahme des Winkels zwischen den peripheren und Membranarmen des CI und eine Abnahme der Krümmung des Membranarms des CI, sowohl untereinander als auch im Vergleich zu den Klassen mit Brücke (Abb. 3c–f). .Die brückenlosen Klassen verloren nicht nur die Untereinheiten der Brückendomäne (NDUFX, NDUA6 und NDUAB1-α), sondern auch zunehmend die Dichte für Untereinheiten oder Untereinheitensegmente an der Schnittstelle zwischen CI und CIII2 (Untereinheit NDUA11, C-Terminus von NDUP9, zwei C -terminale Helices, TMH4 von Nad6, TMH3-4-Schleife von Nad6, C-Terminus von QCR6 und Transmembranhelix von QCR8) (Fig. 3g).Angesichts der Bedeutung einiger dieser Untereinheiten für die Katalyse ist es unwahrscheinlich, dass die brückenlosen Klassen SC I + III2 funktionsfähig sind oder dass der Verlust der Brücke ein regulatorischer Prozess ist, wie zuvor für A. thaliana CI vorgeschlagen (Lit. 11 ).Unserer Ansicht nach sind brückenlose Klassen eher das Produkt einer fortschreitenden Degradation während der Probenreinigung und/oder der CryoEM-Grid-Vorbereitung.a–c, überbrückte (a,b) und brückenlose Klassen von SC I + III2, betrachtet von der Seite (a) oder der Matrix (b,c).Brücke Klasse 1 in Grau, Klasse 2 in hellerem Grau.Brückenlose Klasse 1 bis Klasse 4 in zunehmend helleren Blautönen.Das Sternchen zeigt das Vorhandensein von NDUA11 in der brückenlosen Klasse 1 an. d–f, Unterschiede zwischen verbrückten und brückenlosen Klassen von SC I + III2, betrachtet von der Seite (d), Matrix (e) oder der Rückseite von CI von der Ebene der Membran (f).Überbrückter SC I + III2 Klasse 1 in Grau dargestellt, ausgerichtet mit brückenloser Klasse 4 in Hellblau.Drehungen sind in Bezug auf d angegeben.Die Öffnung des peripheren Arms und die Begradigung des Membranarms sind mit Linien und Pfeilen dargestellt.g, CI- und CIII2-Untereinheiten und Fragmente, die in der brückenlosen Klasse 4 verloren gehen, gezeigt in farbigen Cartoons über der hellblauen Oberfläche der Klasse-4-Karte.h, i, Vergleich der V. radiata-Brückenklasse 1 (grau) und der offensten SC I + III2-Klasse von O. aries (PDB: 6QC4) (Ref. 12) (hellorange), betrachtet aus der Matrix (h) oder der Rücken (ich).Zur Orientierung sind die Positionen des Komplexes III2 (CIII2) und der Untereinheit NDUFV1 (V1) von CI dargestellt.Wir verglichen auch den Winkel zwischen den Armen von CI in O. aries und V. radiata SC I + III2.Obwohl der verbrückte SC I + III2 von V. radiata geschlossener war (kleinerer Winkel zwischen den Armen) als der brückenlose SC I + III2, war er immer noch offener als der offenste SC I + III2 von O. aries (Abb. 3h, i ).Daher ist es allein aus diesem Blickwinkel unklar, ob das verbrückte SC I + III2 von V. radiata als CI in einem „offenen“ oder einem „geschlossenen“ Zustand angesehen werden sollte.Um mehr Klarheit über den Zustand von CI in V. radiatas SC I + III2 zu erhalten, verglichen wir die Merkmale seiner Chinon- und Grenzflächenschleifen mit denen von CI in zuvor beobachteten Zuständen, zum Beispiel offene und geschlossene Klassen in O. aries26, the deaktiver Zustand in Mus musculus25,27 und Yarrowia lipolytica CI in Turnover- und inaktiven Zuständen18.Im Großen und Ganzen wurde bei mehreren Organismen beobachtet, dass Schleifen in den geschlossenen oder Umsatzzuständen geordnet und in den offenen und inaktiven Zuständen ungeordnet werden.Trotzdem stimmten die V. radiata-Schleifen nicht vollständig mit einem einzelnen zuvor beobachteten Zustand überein (Abb. 4a – e und Erweiterte Daten Abb. 7a, b).In der Chinon-bindenden Region war die Nad1-TMH5-6-Schleife von V. radiata in einer Anordnung angeordnet, die der "down"-Konformation der geschlossenen Klasse von Schaf-CI ähnelte, was auch im Hefeumsatz und in den deaktivierten Zuständen zu sehen ist (Fig. 4a).Jedoch befanden sich nicht alle wichtigen Glutamatreste (V. radiata Nad1-Glu207, Glu209 und Glu219) in einem angemessenen Abstand, um Salzbrücken mit wichtigen Argininresten in S7 (V. radiata S7 Arg111 und Arg115) zu bilden, wie in der geschlossenen Hefe vom Schaf zu sehen ist Umsatz und andere Strukturen18,26,38.Die Nad1-TMH5-6-Schleife von V. radiata war nicht äquivalent zu der geordneten Schleife im kürzlich beobachteten „offen-bereiten“ Zustand des Escherichia coli CI entweder37, da Nad1-Glu211 von V. radiata von der S2-β1-2-Schleife wegwies.Darüber hinaus befand sich der Schlüsselrest S7 Arg111 in einer "nicht umgedrehten" Position, ähnlich dem geschlossenen Zustand des Schafs und der Hefe im Turnover- oder deaktivierten Zustand, aber mit einem β-Strang für die Reste S7-Pro81-Leu86, die typisch für den offenen Zustand des Schafs und den deaktivierten Zustand der Hefe sind (Abb. 4b).Die S2-β1-2-Schleife war in Übereinstimmung mit der offenen Klasse des Schafs und dem deaktiven Zustand der Maus ungeordnet, aber nicht mit dem deaktiven Zustand der Hefe (Fig. 4c).Was die Schleifen an der Schnittstelle zwischen den Armen von CI betrifft, so war die Schleife von Nad3 TMH1-2 über ihre gesamte Länge ungeordnet, was dem deaktiven Zustand der Maus ähnelt (Abb. 4d).Die Nad6-TMH3-4-Schleife von V. radiata wurde bestellt, aber das Nad6-TMH3 zeigte die charakteristische π-Ausbuchtung, die in den offenen und deaktiven Säugerstrukturen sowie in den deaktiven und Turnover-Hefestrukturen zu sehen ist (Fig. 4e).Wichtig ist, dass sich TMH4 von V. radiata Nad6 in einer „distalen“ Position an der Schnittstelle zwischen TMH1 von Nad4L und TMH16 von Nad5 befand (Abb. 4f).Dies ist etwa 14 Å entfernt von der Position von Nad6 TMH4 in den offenen/geschlossenen Klassen der Schafe, etwa 16 Å entfernt vom deaktiven Zustand der Maus und etwa 25 Å entfernt vom geneigten Nad6 TMH4 im „deaktiven“ Zustand der Schafe26 (dem es an Dichte mangelt für NDUFA11 und ND5 und ähnelt daher eher dem sogenannten „Zustand 3“-CI, d. h. in den Anfangsstadien des Abbaus28).Vielmehr ähnelte die Position von V. radiata Nad6 TMH4 am ehesten der in Thermus thermophilus mit oder ohne Substrate39,40 sowie der in E. coli in offenen, offenen oder geschlossenen Strukturen37, mit Ähnlichkeiten zur Struktur von Tetrahymena thermophila13 und der Y. lipolytica-Deaktivierungszustand18 (Abb. 4f).a–e, Artenvergleich von CI-Schleifen im Zusammenhang mit Katalyse, zeigt das V. radiata-Modell und die zugehörige Dichte (grüne Karikatur, transparente Karte) (links) und das Modell für die Struktur, der es am ähnlichsten ist, gefärbt nach Struktur (rechts).a, Nad1-TMH5-6-Schleife;O. aries native geschlossen (hellorange), PDB: 6ZKO26.b, NDUFS7-α1-2-Schleife (links) und α2-β1-Schleife (rechts).Schlüssel-Argininrest (R) und β-Strang sind markiert;O. aries native Closed Class mit 'unumgedrehtem' Arginin in der β1-2-Schleife, β-Strang für die α2-β1-Schleife (hellorange, links), PDB: 6ZKO26 und O. aries native open mit umgedrehtem Arginin und β-Strang ( gelb, rechts), PDB: 6ZKP26.c, NDUFS2-β1-2-Schleife;M. musculus deaktiviert (dunkelorange), PDB: 6G72 (Ref. 25).d, Nad3-TMH1-2-Schleife;M. musculus deaktiviert (dunkelorange), PDB: 6G72 (Ref. 25).e, Nad6-TMH3-4-Schleife;Thermus thermophilus native (hellblaugrün), PDB: 4HEA64.f, Position von Nad6 TMH4 über Organismen und Bedingungen hinweg.Strukturen ausgerichtet von Nad6.Die V. radiata Nad5 TMH16 und Nad4L TMH1 zur Orientierung gezeigt (graue Karikatur).Struktur: V. radiata (grün, diese Studie), T. thermophilus nativ (hellblaugrün, PDB: 4HEA64), Tetrahymena thermophila nativ (cremefarben, PDB: 7TGH13), Yarrowia lipolytica deaktiv (braun, PDB: 7O71 (Ref. 18) ), O. aries native closed (light orange, PDB: 6ZKO26), O. aries native open (yellow, PDB: 6ZKP26), M. musculus deactive (red, PDB: 6G72 (ref. 25)), O. aries ' deaktiv' (blau, PDB: 6KZS26).g, h, A/D-Übergang in den Mitochondrienmembranen von S. scrofa (g) und V. radiata (h).Membranen wurden mit 2 mM NEM wie isoliert (orange, grün) oder nach thermischer Deaktivierung (hellorange, hellgrün), in An- oder Abwesenheit einer Voraktivierung mit 5 μM NADH (S. scrofa) oder 5 μM dNADH (V . Radiata).Die Werte sind der Prozentsatz der durchschnittlichen Aktivitäten (NEM/kein NEM), die aus vier bis zehn unabhängigen Messungen an einzelnen Proben von isolierten S. scrofa- oder V. radiata-Mitochondrienmembranen bestimmt wurden, die in Abb. 7 der erweiterten Daten gezeigt werden. Fehlerbalken entsprechen dem Variationskoeffizienten für das Verhältnis errechnet sich aus der Summe der Variationskoeffizienten der einzelnen Kurse multipliziert mit dem Wert des Verhältnisses.Die statistische Signifikanz der Differenz zwischen den Verhältnissen wurde unter Verwendung eines zweiseitigen z-Tests bestimmt.*P < 0,05 (P = 0,02 für deaktivierte S. scrofa).NS, statistisch nicht signifikant (P > 0,05).Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Schleifenkonformationen in unserer V. radiata-Struktur nicht sauber mit den zuvor beschriebenen offenen oder geschlossenen CI-Zuständen korreliert werden können, noch dass sie vollständig äquivalent zu dem deaktivierten Zustand in Säugetieren oder Hefe sind.Nichtsdestotrotz deutet das Vorhandensein der π-Wölbung in Nad6s TMH3, die hydrophobe Reste in die hydrophile Achse von CI dreht und den Wasserdraht unterbricht, von dem angenommen wird, dass er für das Protonenpumpen erforderlich ist26,35, darauf hin, dass unsere Struktur CI in einem Ruhezustand enthält.Nach unserem Wissen wurde die Existenz des A/D-Übergangs bisher nicht in Pflanzen untersucht.Daher testeten wir die Fähigkeit von V. radiata CI, den A/D-Übergang zu durchlaufen, indem wir einen Standardassay mit isolierten Mitochondrienmembranen verwendeten30,31,41,42.In diesem Assay wird CI deaktiviert, indem die Membranen bei 37 °C in Abwesenheit von Substrat inkubiert werden, was zu einer Störung des aktiven Zentrums und einer möglichen großflächigen Öffnung der Struktur führt27.Dann wird N-Ethylmaleimid (NEM) hinzugefügt, um CI in der deaktiven Konformation zu „fangen“, indem ein konserviertes Cystein in der TMH1-2-Schleife von Nad3 (Cys44 in V. radiata) modifiziert wird, das im deaktiven Zustand exponiert, aber im aktiven nicht zugänglich ist Zustand.Daher verhindert die NEM-Modifikation die Reaktivierung von CI, was zu einer Verringerung der beobachteten NADH-Oxidationsrate führt.Die nachteiligen Wirkungen von NEM können minimiert werden, indem der Komplex vor der Inkubation mit NEM mit einer niedrigen Konzentration von NADH (Substrat) voraktiviert wird.Wir verglichen die Reaktion von V. radiata auf den A/D-Assay mit der von mitochondrialen Säugetiermembranen, die aus Sus scrofa (Schwein) isoliert wurden, dessen CI bekanntermaßen einen „klassischen“ A/D-Übergang durchläuft30.Wie erwartet verringerte die Exposition von Schweine-Mitochondrienmembran gegenüber 2 mM NEM die CI-Raten, sowohl für thermisch deaktivierte als auch für "wie isolierte" (nicht deaktivierte) Membranen.Der NEM-Effekt wurde teilweise durch Voraktivierung mit 5 μM NADH in beiden Fällen aufgehoben.Darüber hinaus war die inhibitorische Wirkung von NEM bei deaktivierten Membranen erwartungsgemäß höher als bei nicht deaktivierten Membranen (Abb. 4g und Erweiterte Daten Abb. 7c).Wir führten ähnliche Assays mit mitochondrialen Membranen von V. radiata durch.Um die Auswirkungen der mitochondrialen alternativen NADH-Dehydrogenasen von Pflanzen auszuschließen, verwendeten wir das NADH-Analogon DeaminoNADH (dNADH), das von CI als Substrat verwendet werden kann, aber nicht von den alternativen Dehydrogenasen43,44,45,46 (Erweiterte Daten Abb. 7d) .Obwohl V. radiata-Membranen auch anfällig für NEM waren, zeigte ihre Anfälligkeit keine wesentlichen Änderungen bei thermischer Deaktivierung (Abb. 4h und Erweiterte Daten Abb. 7d).Dies steht im Einklang mit der Inkubation ohne Substrate bei einer erhöhten Temperatur, die nicht zu einer erhöhten Exposition der THM1-2-Schleife von Nad3 führt.Darüber hinaus änderte sich die Anfälligkeit von V. radiata gegenüber NEM nach Voraktivierung mit 5 μM dNADH nicht (Abb. 4h und Erweiterte Daten Abb. 7d).Das heißt, Pflanzen-CI war genauso anfällig für NEM, unabhängig davon, ob das Enzym kürzlich umgedreht war oder nicht.Dies deutet darauf hin, dass Pflanzen-CI nicht in biochemisch unterschiedliche Zustände eintritt, die den A- und D-Zuständen entsprechen, die in Säuger-CI beobachtet werden, möglicherweise aufgrund des Vorhandenseins der Brückendomäne.Insgesamt zeigte das CI von V. radiata in SC I + III2 nicht-kanonische Eigenschaften in Bezug auf seine großräumige Struktur, seine katalytischen Schleifen und sein Verhalten im Standard-A/D-Assay.Hier präsentieren wir die CryoEM-Struktur von aktivem SC I + III2, gereinigt aus V. radiata Mitochondrien, zusammen mit einer funktionellen Untersuchung des A/D-Übergangs in isolierten Mitochondrienmembranen.Die Anordnung SC I + III2 schützte mehrere CI-Untereinheiten an der Schnittstelle mit CIII2.Daher enthielt unsere Rekonstruktion die vollständige Struktur von CI, einschließlich der akzessorischen Untereinheit NDUA11, zusätzlicher TMHs der Kernuntereinheiten Nad5 und Nad6 sowie einer neu zugeordneten, wahrscheinlich pflanzenspezifischen CI-Untereinheit NDUP9 (Abb. 1 und Erweiterte Daten Abb. 1– 3).Wissenschaft.Nat.Mol.Biol.Chem.Nat.Zellbiol.Proz.Wissenschaft.Nat.Mol.Proz.Wissenschaft.Int.Wissenschaft.Wissenschaft.J.Biol.Chem.Nat.Mol.Biol.Nat.Biochem.Zellstoffwechselakt.Biol.Marmelade.Chem.Soc.Wissenschaft.Nat.Med.Mol.Mol.Biochem.Nat.Biol.Biol.Nat.Nat.Nat.Chem.Nat.